Modern Dünya’nın Tedavi Yöntemleri: GEN TERAPİSİ

Modern Dünya’nın Tedavi Yöntemleri: GEN TERAPİSİ

Modern Dünya’nın Tedavi Yöntemleri: GEN TERAPİSİ

Giriş ve Yöntemleri:

Genetik hastalıklara sebep olan doku ve organlaımızda 75.000 farklı mutasyon var.

Gen tedavisi türleri 2 ye ayrılıyor. Somatik gen terapisi ve germline (eşey hücreler) gen terapisi. Germline gen terapisi, bebeğin hayatına sebep olabilecek genetik hastalıkları ister viral vektörle ister direk gen aktarımı yöntemiyle olsun alınan eşey hücreler laboratuvar ortamında genetiği değiştiriliyor ve embriyo laboratuvar ortamında oluşturuluyor ve hastaya geri veriliyor. Böylelikle doğan bebeklerin genetiği değiştiriliyor ve hastalık tedavi edilmiş oluyor. Bu yöntem, hastanın vücudunda bulunan bütün hücrelerin genetiği değiştirilmiş oluyor ve aynı zamanda bu modifikasyon hastada kalmış olmuyor ve bir sonraki nesile de aktarılıyor. Bu yüzden germline tedaviler halen riskli bulunuyor ve etik olup olmaması tartışılıyor.

Somatik gen terapisi ise bilim insanları tarafından daha sık kullanılan bir tedavidir. Adı üstünde insandan alınan hücreleri laboratuvarda (ki buna ex-vivo yada in-vivo deniyor) yada insanın kendi vücudu içerisinde genetik tedavi tasarımını virüs yöntemiyle gibi farklı yöntemlerle aktardıktan sonra hedef dokuyu tedavi etmeyi sağlıyor. Yani aslında somatik gen terapisi, hastanın hedef hücrelerinin genetiğini değiştiriyor ve bir sonraki nesile aktarılmıyor. Gen tedavi türleri kısaca bu şekildeydi. Peki somatik gen tedavi yöntemlerini ve germline gen tedavi yöntemlerini daha detaylandırırsak karşımıza ne çıkar? Aşağıda gördüğünüz görsel bunu çok iyi açıklıyor.

Somatik Gen Terapisi:

Daha detaylı inceleyecek olursak, ilk olarak in-vivo ve ex-vivo’nun ne anlama geldiğinden bahsetmek isterim. In-vivo, yapılan genetik tasarımı hastanın vücuduna enjekte edilerek yapılan bir yöntemdir ve kandan damar yolu ile aktarılır. Ex-vivo ise, hastanın hücrelerini vücudundan alıp laboratuvar ortamında genetiği değiştirilerek tekrar hastaya verilmesidir. 1. görselde olmayıp başka bir yöntem daha var, o ise In-situ yöntemdir. In-situ yöntem in-vivo’ya benzer bir yöntemdir. In-situ, direk düzeltmek istenen yani tamir etmek istenen dokunun içerisine aktarılmak istenen genin aktarılmasıdır.  

Şemada da göründüğü gibi bütün bu yöntemlerle, ister mRNA’yı ister cDNA’yı veya direk plazmid DNA’yı yada antisensoligonükleotidleri hedef hücrenin içerisine aktarılabilinir. Ve bu hedef hücrenin içerisine girdikten sonra mesela lentivirüs gibi bir yöntemse genomun içine entegre olabilir yada CRISPR gibi bir yöntemse genom editleme veya mRNA gibi bir yöntemse hücrede sitoplazmada kalıyor. Her yöntem avantaj ve dezavantaja sahiptir. Örnek verilecek olursam, mRNA yöntemi kalıcı bir yöntem değildir ama daha az toksik oluşturur ve aynı zamanda ucuz bir yöntemdir. Diğer taraftan hücre delici peptidler (cell penetrating peptid) ise hedef dokuya spesifik olarak alabiliyoruz ve proteini direkt olarak aktarabiliyoruz. Burada ki avantaj ise, mRNA’ya hiç gerek kalmadan işlevini kaybetmiş protein yerine işlevini yerine getirecek olan proteini aktarabiliyoruz.

İlk Gen Tedavisi Ne Zaman Yapıldı?

1990 yılında, ADA ismi verilen bir gen eksikliğinde oluşan ADA-SCID yani bağışıklık yetmezliği hastalığı olan Ashanti DeSilva adında 4 yaşındaki bir çocuğa uygulandı. Bu hastalığa sahip olan hastlar çok düşük bir immün sisteme sahip oldukları için havada herhangi bir patojenden korunmak zorundalar bu yüzden hayatları boyunca balonun fanusların içinde yaşamak zorundalar. İşte bu hastalığı tedavi etmek için, 1990 yılında “lentiviral” yöntemi kullanılıyor.

Peki lentiviral yöntemi nedir? Nasıl uygulanır?

Gerekli olan T-hücreleri (bağışıklık sisteminin önemli bir parçası olan lökosit türü (beyaz kan hücresi)) alınıyor. Ardından, ADA genin fonksiyonel halini lentivirüs yöntemiyle hücreye ekleniyor. Ve bu hücre laboratuvar ortamında çoğaltılıyor ve artık T-hücreleri fonksiyonel ADA genli hücrelerini protein üretimi gerçekleştiriyor. Daha sonra bu hücreler laboratuvar ortamında çoğaltıldıktan sonra hastaya enjekte ediliyor. Bu şekilde hastanın T-hücreleri yani bağışıklık sistemi herhangi bir dışarıdan gelen patojene karşı savaşmış oluyor. Burada uygulanan gen tedavisi yukarıda anlattığım gibi ex-vivo gen tedavisidir.

Gen Tedavi Stratejileri:

Bir çok aktarım stratejileri mevcuttur. Bunlar, adenovirüs, lentivirüs retrovirüslerdir daha fazlası. Aşağıda bulunan şema da daha rahat anlaşılacaktır. Bu aktarım stratejilerinden belki başka bir yazıda bahsedebilirim.

Gen tedavi stratejilerinden ilk olarak, Gen Augmentation Therapy, GAT. Çevirisi Türkçeye Gen Büyütme Terapisi olarak çevriliyor. GAT, bozuk gene sahip olan hücrenin içersine fonksiyonel bir geni aktararak tekrardan düşük olan protein ekspresyonunu tekrardan büyültülebilir. Yukarıda örnek verdiğim ilk gen terapisi uygulaması da GAT ile yapıldı. GAT’ın en büyük avantajı, birçok mutasyona sebep olan genin tek bir gen aktarımı ile bütün mutasyonlar düzeltilebilir. Lakin diyelim ki, genin promoter dediğimiz bölgesinde ve enhancer bölgesinde mutasyon varsa biz genin bozuk olan yerini ne kadar düzeltsek de bu bölgeler bozuk olduğu için çalışmayacaktır. Bu yüzden, GAT’ı uygularken de promoter ve enhancer element seçmek gerekecektir.

Bir diğer strateji ise, Belirli Hücrelerin Hedefli Öldürülmesi, bu yöntem çoğunlukla kanser tedavilerinde kullanılıyor. Eğer hastalıklı bir hücre hastalığa sebep oluyorsa, bu hücreyi öldürmeyi ölümcül bir sebep olmayacaksa, sadece hastalıklı hücreye etki edecek suicide genler aktarılabilir. Bu suicide genler aktarıldıktan sonra toksik bir ilaç da verildiğinde hücrede DNA’nın ekspresyonun ilerlemesini durduruyor ve hücre ölüyor.

Peki, genetiğini değiştirdiğimiz hücreyi nasıl seçeceğiz, genetiğini değiştirdiğimiz hücreyi hastaya nasıl vereceğiz? Bu anlatacağım yöntemde ise, hastalıklı hücreyi alıp gen aktarımı yapacaksak GAT yada gen editing yöntemlerini kullanırken bu genleri aktarırken genlerin arkasına marker gen yada işaretleyici bir gen koyulmalıdır. Marker genler hücre yüzeyinde ekspresyon oluyor ve bu şekilde immün sistem o hücreye atak yapıyor ve hücreyi öldürüyor.

3. stratetji ise Oligonükleotitler terapötüklerinin dört ana sınıfı vardır. Bunlar 2. Figürde yer aldığı gibi, siRNA(small interferance RNA), Antisensler, immünostimulatory ve aptemerler.

Antisensler:

Hedef mRNA’yı baskılamak için veya hedef mRNA’da exon atlama yapmak için yada splicing modifiye etmek için RNA’ya yada hedef RNA’ya tam karşılık gelebilecek bir antisense oligonükleotit tasarlanıyor. Buda yaklaşık 20 ile 25 bazlık bir uzunlukta.

siRNA:

Antisenslerin benzerlerini siRNA’da çift zincirli olarak tasarlanıyor. Hücreye aktardıktan sonra Antisens de RNase H mekanizması devreye giriyor. siRNA’de mekanizma aktive oluyor ve burada da mRNA bağlanıyor ve mRNA’nın proteine dönüşmeden kesilmesine sebep oluyor.

Burada her 2 yöntem de gen ekspresyonunu baskılamak için kullanılan yöntemler.

Immünostimulatory:

Bağışıklık sisteminin zayıf ve yetersiz olan hastaların, hastalığa karşı daha çok bağışıklığı sağlamak için vücuda CpG denilen DNA parçaları veriliyor ve daha sonra makrofajlar belli reseptörler aracılığıyla CpG parçalarını tanıyor. Bu sayede bağışıklık sisteminini uyararak immun düzenleyici hale geliyor.

Aptamerler:

Eğer bir proteinin fonksiyonu hastalık yapıyorsa ve bu fonksiyonu durdurmak istersek, tamamen proteine bağlanabilen fonksiyonel parçalara ve proteini işlevsiz hale getirebilen oligonükleotitlere “aptamerler” denir

Bir diğer strateji Oligonükleotitlerin alt başlığı olan, Gen İfadesinin Hedefli İnhibisyonu. Burada antisens oligonükleotitlerden bahsedeceğim. Gerek triplex-forming oligonükleotit (TFO) gerekse antisense oligonükleotitler hücreye aktarıldıktan sonra DNA-RNA yada RNA-RNA dublexler oluşturulabiliniyor. Bunlar siRNA da olur antisense de olur. Antisenslerde RNA üstüne bir DNA hedefelenen bölgeye bağlanabiliyor ve burada triplex bir yapı oluşturulıyor. Böylelikle bu yapı RNase H ile birlikte hedefli inhibisyona maruz kalıyor ve böylelikle mRNA ekspresi olmadan kesilebiliyor.

Antisens mekanizmaları genel olarak iki genel kategoriye ayrılabilir

RNA’nın bozulmasını destekleyen mekanizmalar;

• RNase H – tek zincirli (ler) DNA ASO’lar

• siRNA ve miRNA – çift sarmallı (ds) ve ssRNA ASO’lar

RNA’nın bozulmasını desteklemeyen mekanizmalar;

• Çevirisel tutuklama – değişken kimyaya sahip ssASO’lar

• Splice modülasyonu – değişken kimyaya sahip ssASO’lar

• miRNA antagonistleri – değişken kimyaya sahip ssASO’lar

Splice- switching AntiSense Oligonucleotide (SSO):

Şimdiki anlatacağım kısım çok önemli çünkü yukarıda anlattıklarımın nasıl çalıştığından detaylı bir şekilde bahsedeceğim. Yani aslında burada hastalıklara tedavi bulunurken ki yöntemi açıklayacağım. Sadece şöyle bir sıkıntı var. Bu yöntemi SMA hastalığında kullanabilirken diğer nadir hastalıklarda bir tane risk var. O da şu, eğer exonun atlanması yani o exonun atlanarak ekspresi edilmemesi proteinin fonksiyonel yapısını bozmuyorsa exon skipping yani ekzon atlama yöntemi kullanılabilir. Yani aslında bu yöntemi kullanabilir ve CRISPR yöntemini kullanmak yerine bu yöntem daha avantajlı olabiliyor aynı zamanda bir başka olumlu yanları ise ucuz ve çok kolay bir yöntem. Olumsuz yanı ise, aynı mRNA yöntemindeki gibi kalıcı bir yöntem değil. Peki 1 numaralı yöntemimiz exon skipping nasıl çalışıyor? Burada kullanacağım görsel yöntemi iyi bir şekilde açıklayacaktır.

1. Exon Skipping

Görselde gördüğünüz gibi, burada splicelar var. pre-mRNA denilen ise, daha son haline gelmemiş mRNA ya deniyor ve pre-mRNA da intronlar da bulunur. ASO’ları yani antiSense Oligonükleotitleri exon ve intron bölgelerinde bulunan splicing bölgelerine yerleştirirsek -renk olarak açıklamak gerekirse, açık mavinin olduğu yere- splicing yani ek olan bölgelere bağlanamıyor ve intronlar uç noktalarından kesilmiyor. mRNA da ki halini almak içinse, soldaki exonun uç kısmından ve sağdaki exonun baş kısmından kesiyor ve protein bu şekilde kısalıyor yani aradaki bozuk olan mutasyonlu exon atlanıyor. Protein bu noktada kısalsa da fonksiyonel yapısı bozulmuyor ve bu şekilde hastalığın önüne geçiliyor.

2. Exon Retention

Bir diğer yöntemse Exon Retention(tutma). Kırmızı bölge exon bölgesi ve bu bölgede mutasyon etki ile exon splicing oluşmuşsa protein direk ortadan kesildiği için protein eksprese edilemiyor. Buda şuna sebep oluyor, eğer protein ortadaki exona ihtiyaç duyuyorsa işlevini kaybediyor. Buda hastalığa sebep oluyor. Proteini işlevsel hale getirmek içinse, exon splicing bölge (kırmızı bölge) belirleniyor ve tam bunun üzerine ASO’ları –yaklaşık olarak 20-25 bazlık bir dizi- yerleştiriyoruz ve bu noktaları kesemediği için mutasyonlu olan exon ve diğer düzgün exonlarla birleşerek protein fonksiyonel hale getiriliyor.

3. Restoration of Correct Splicing

3. yöntemimiz de ise, exonun içerisinde fazladan bir splicing bölge varsa arada sanki fazla exon varmış gibi olup proteinin fazla uzun olmasına ve proteinin işlevini kaybetmesine sebep oluyor. Bunu düzeltmek içinde, görselde görünen yere ASO koyuluyor ve splicing bölgeler buraya bağlanamıyor ve normal bağlandığı yerlerden exonu keserek 3 exonu biraraya getiriyor ve bu şekilde protein olması gerektiği boyda oluyor.

4. Displacement of Splicing Factors

4. yöntem son yöntemimiz. Ve diğer 3 yönteme göre daha az kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem nasıl çalışıyor? 3. mavi olan exona splicing faktörleri daha fazla bağlayıp yan tarafında bulaln exonla birleştirmek isteniyor ve yine diğer yöntemlerdeki gibi intron bölgeler kesiliyor, splicing faktörler görseldeki yerlere yoğunlaştırıp kesilebiliniyor ve son mRNA’daki haline getirilebiliniyor.

Bu yöntemleri yaparken şuna dikkat edilmesi gerekiyor: Eğer düzeltmek istediğimiz hastalıkda splicing bölge yani bu şekilde mutasyonlu bölge var ise biz bu yöntemleri kullanabiliriz. Yada diyelim ki, bir exon da yüksek oranda mutasyon varsa exon skipping yöntemle düzeltilebilir. Bunu da bilmek için o hastalığı iyi araştırmak gerekiyor.

Oligonükleotid (OT) terapötiklerinin özellikleri:
  • Ucuz fakat kısa yarı ömürdür
  • Metabolik instabilite – nükleazların bozulması
  • Renal klerens – glomerüler filtrasyon ile eliminasyon
  • OT’lerin büyük çoğunluğu nükleazı engellemek için kimyasal olarak modifiye edilmiştir ve böylece etki süresini uzar
  • OT’ler kimyasal olarak konjuge edilir veya kolaylaştırmak için kapsüllenir
Antisens Oligonükleotidler (ASO’lar)’in Özellikleri:
  • ssDNA, 2 modifiye, ~ 20 mer (klasik tasarım)
  • Genellikle aralıklı SC veya IV yollarıyla uygulanır
  • Yüksek derecede protein bağlanması (çoğunlukla albümin)
  • Nükleazlara karşı son derece kararlı
  • Plazmadan belirli dokulara ve hücrelere hızlı bir şekilde dağılması ve bu bölgelerde uzun süreli kalıcılık

Şimdi ise başka bir yöntem olan ama yine oligonükleotit sınıfına giren “Ribozim”lerden bahsedeceğim. Ribozimin bir farkı 3 boyutlu olmasıdır. Aşağıdaki görselde gördünüğünüz gibi, soldaki RNA yapısı 3D hale gelerek ribozimi oluşturuyor. Ribozimler splicing bölgeyi kesmeye yarıyor. mRNA’da bir mutasyon varsa ve bu mutasyon yüzünden bozuk bir protein ortaya çıkıyorsa ribozime bağlı artık neresi bozuksa RNA’nın terapötik RNA olarak ribozimin arkasına ekleniyor. Demek istediğim şu, ribozim hedef olan mRNA’ya bağlanıyor. Daha sonra, ribozimin nükleaz aktvitesi hedeflenen yeri kesiyor sonra ribozimin arkasına eklenen olması gereken protein eklenirse (mutasyonlu genin yerine) burada homolog kombinasyon oluşuyor. 3’ exon daki doğru olan protein giderek mRNA’ya bağlanıyor bu sayede bozukluk olan mRNA tamir oluyor ve burada istediğimiz doğru olan mRNA ekspresyonu ortaya çıkıyor.

Bu tekniğin yani yöntemin sağladığı avantaj, genin kendisini homolog rekombinasyona tabii tutulmuyor yani buda bize şunu sağlıyor, istenmeyen genomun başka bir yerde mutasyon var olup olmadığına olasılık yer vermiyor. Aslında bu yöntemin gelişmiş hali günümüzde çok iyi biliniyor “CRISPR”.

Gen tedavilere giriş ve stratejilerini bu yazımda açıkça yazdım. Umarım bilgilendirici olmuştur. Bu alan derya deniz! daha yazmak istediğim çok konu var ve bunları planlı bir şekilde yayınlamayı düşünüyorum.

REFERANSLAR:

  1. Taştan C., 2020: Rare Disease Challenge’20 Yarışma Notları
  2. Dean N.M., Benette C.F., 2003: Antisense oligonucleotide-based therapeutics for cancer
  3. Lee H.L., Han S.R., Lee S.W., 2017: Therapeutic applications of group I intron-based trans-splicing ribozymes
  4. Başkan E.B., 2013: T hücre immunitesi
  5. Britannica Sözlük: https://www.britannica.com/science/T-cell

Görüş ve önerileriniz için

6 Beğen

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir